Виртуальный практикум «Изучение окислительного фосфорилирования в митохондриях» принадлежит к числу сложных заданий, требующих от школьника определенной самостоятельности как в выборе условий постановки эксперимента, так и в трактовке полученных результатов. Поэтому в том случае, если для каждого ученика в классе будет разработана индивидуальная траектория обучения, к работе с этим практикумом следует привлекать учащихся, проявляющих определённый интерес к курсу биохимии и обладающих хорошим логическим мышлением. Более слабых учеников можно знакомить с данным практикумом в режиме демонстрации.

Занятие с использованием виртуального практикума целесообразно организовать в конце изучения всего курса биохимии, поскольку для его выполнения учащимся необходимо изучить материалы урока 12 «Окислительное фосфорилирование». Необходимо дать указание учащимся, которые будут выполнять работу с данным виртуальным практикумом, перечитать материалы урока 12, описывающие механизм работы белков-переносчиков дыхательной цепи, действие ингибиторов транспорта электрона, сопряжение окисления с фосфорилированием (дыхательный контроль) и действие разобщителей (стр. 1–5 урока 12 в данном пособии).

В демонстрационную часть практикума включены три задания. В первом из них наблюдается явление дыхательного контроля. Школьники имеют возможность ознакомиться с полярографическим методом измерения содержания кислорода, увидеть активацию дыхания митохондрий при добавлении АДФ и фосфата, а затем возвращение его к исходному уровню после переработки всего АДФ в АТФ. В этом же задании демонстрируется исчезновение этого эффекта после добавления ингибитора АТФ-синтетазы (олигомицина), а также необратимая стимуляция дыхания разобщителем (динитрофенолом). Во втором задании ученики могут наблюдать влияние различных ингибиторов дыхательной цепи митохондрий на окисление различных субстратов. Они могут увидеть, что ингибитор ротенон блокирует окисление НАД∙Н, который образуется при превращениях α-кетоглютарата в цикле Кребса. Затем они могут убедиться, что сукцинат поставляет электроны в дыхательную цепь в обход пункта, блокируемого ротеноном, но ингибитор антимицин А действует на дальнейшем этапе дыхательной цепи и блокирует окисление суцината. Наконец, они могут увидеть, что аскорбат поставляет электроны в дыхательную цепь дальше пункта, блокируемого антимицином А, но ингибитор цианид действует на последнем этапе дыхательной цепи и блокирует его окисление. Наконец, в третьем задании, виртуально наблюдая окисление различных субстратов в условиях синтеза АТФ, школьники могут убедиться, что энергетическая ценность окисления НАД∙Н, образующегося при превращениях α-кетоглютарата, выше, чем окисления сукцината, который, в свою очередь более ценен, чем аскорбат.

В самостоятельную часть виртуального практикума включены три задачи – определение трёх неизвестных веществ, нарушающих нормальную деятельность митохондрий. Школьник должен поставить виртуальные эксперименты по изучению влияния неизвестного вещества на дыхание митохондрий в определённых условиях, и по их результатам определить неизвестное вещество из предлагаемого списка. Список возможных ядов включает пять веществ: ротенон, антимицин А, цианид, олигомицин и динитрофенол. Ученик имеет возможность исследовать влияние неизвестного вещества на дыхание митохондрий с такими субстратами как α-кетоглютарат, сукцинат и аскорбат. Он имеет возможность увидеть влияние изучаемого вещества на дыхание в присутствие разобщителя динитрофенола, а также в присутствие субстратов для синтеза АТФ: АДФ и фосфата.

Наиболее целесообразной схемой проведения экспериментов по идентификации неизвестного яда является нижеприведённая.

Эту схему не следует сразу же приводить школьникам, желательно, чтобы они разработали собственную стратегию изучения неизвестного вещества.

Определяемыми веществами являются ротенон, цианид и динитрофенол. Совершенно нецелесообразно сообщать это школьникам, тем самым сразу же сужая круг поиска и облегчая задачу. Какое именно вещество требуется определить в данной постановке – неизвестно, это задаётся случайно.

Первый возможный вариант определяемого вещества – ротенон. Это ингибитор дыхательной цепи, угнетающий самый первый её этап – окисление НАД∙Н. Школьник может найти верное решение задачи несколькими различными путями. Во-первых, он может самостоятельно создать план исследования неизвестного яда, идентичный приведённому на стр. 2. Во-вторых, он может сразу же исследовать влияние неизвестного яда на окисление различных субстратов дыхательной цепи в присутствии разобщителя – динитрофенола. Именно такого типа эксперимент показывался в демонстрационном режиме в задаче 2. В этих условиях в митохондриях не идёт синтез АТФ, а происходит быстрое окисление субстратов с рассеянием энергии в виде тепла. Учащийся добавляет в ячейку динитрофенол, один из трёх субстратов окисления и неизвестный яд. Ученик сможет увидеть, что предлагаемый яд угнетает окисление α-кетоглютарата, но не сукцината и аскорбата. Этой информации достаточно для правильного выбора ингибитора из списка: антимицин А или цианид угнетали бы также и окисление сукцината (а цианид ещё и аскорбата). Динитрофенол и олигомицин не угнетали бы окисление никаких субстратов в присутствии динитрофенола (первое очевидно; олигомицин – ингибитор АТФ-синтетазы – не влияет на дыхание в присутствии разобщителей, поскольку вся энергия в этих условиях идёт не на синтез АТФ, а в тепло). В-третьих, ученик может исследовать действие неизвестного яда на окисление различных субстратов в условиях, позволяющих произвести синтез АТФ. Учащийся добавляет в ячейку неизвестный яд, один из трёх субстратов окисления и АДФ + фосфат. Он сможет увидеть, что в присутствии яда не происходит активации дыхания только в том случае, если субстратом был α-кетоглютарат, в остальных случаях ингибитор не действовал. Этой информации достаточно для правильного выбора ингибитора из списка: антимицин А или цианид угнетали бы также и окисление сукцината (а цианид ещё и аскорбата). Динитрофенол активировал бы дыхание резко и необратимо, а не угнетал его при окислении одного из субстратов. Олигомицин бы в этих условиях блокировал активацию дыхания при окислении всех трёх субстратов (он блокирует синтез АТФ, а в условиях сопряжения если нет синтеза АТФ, то не происходит и окисления).

Второй возможный вариант определяемого вещества – цианид. Это ингибитор дыхательной цепи, угнетающий самый последний её этап – цитохромоксидазу. Верное решение также может быть найдено несколькими разными путями, один из которых приведён на стр. 2. При другом способе школьник может сразу изучить влияние неизвестного яда на окисление различных субстратов дыхательной цепи в присутствии разобщителя – динитрофенола. Учащийся добавляет в ячейку динитрофенол, один из трёх субстратов окисления и неизвестный яд. Ученик сможет увидеть, что предлагаемый яд угнетает окисление и α-кетоглютарата, и сукцината, и аскорбата. Этой информации достаточно для правильного выбора ингибитора из списка: ротенон или антимицин А не угнетали бы окисление аскорбата (а ротенон также и сукцината). Динитрофенол и олигомицин не угнетали бы окисление никаких субстратов в присутствии динитрофенола. Школьник может пойти и третьим путём: добавить в ячейку неизвестный яд, один из трёх субстратов окисления и АДФ + фосфат. Он сможет увидеть, что в присутствии яда не происходит активации дыхания при окислении любого из трёх субстратов. Однако для точного определения яда этих сведений недостаточно: олигомицин в этих условиях действовал бы так же, как цианид. При условии сопряжения окисления с фосфорилированием блокатор синтеза АТФ препятствует окислению любых субстратов. Поэтому в случае третьего пути для правильного ответа школьник должен поставить ещё один опыт: посмотреть, сможет ли изучаемый яд заблокировать окисление любого субстрата в присутствии разобщителя – динитрофенола. Олигомицин в этих условиях не подействует, следовательно, исследуемое соединение – цианид.

Последний возможный вариант определяемого вещества – динитрофенол. Школьник может найти верное решение задачи различными путями, самый быстрый изображён на стр. 2. Если он посмотрит влияние неизвестного яда на окисление любого субстрата дыхательной цепи в отсутствие АДФ и специально добавленного динитрофенола, то он увидит необратимую активацию дыхания. Это сразу же позволяет определить, что исследованный яд является разобщителем, а в списке только один разобщитель – динитрофенол. Другой способ – наблюдать окисление субстратов в присутствии динитрофенола, тогда он увидит, что изучаемый яд в этих условиях никак не действует; это должно навести его на мысль, что таким ядом может быть или олигомицин, или динтрофенол. На следующем этапе он должен поставить ещё один опыт: влияние яда на окисление любого субстрата в отсутствие АДФ и фосфата. Только разобщитель (в данном случае динитрофенол) будет активировать такое окисление.

В самом начале урока целесообразно среди учащихся, которые будут работать с этим практикумом, провести опрос, проверяющий степень знакомства с материалом. Возможны следующие варианты вопросов:

• Почему митохондрии поглощают мало кислорода, когда клетка обеспечена АТФ?

  Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что в живых митохондриях окисление различных субстратов переносчиками дыхательной цепи сопряжено с фосфорилированием – синтезом АТФ. Если в клетке много АТФ и мало АДФ, то дальнейший синтез АТФ невозможен, и окисление прекращается. Это явление называется дыхательным контролем.

• Как повлияет добавление разобщителей на скорость окисления субстратов дыхательной цепи в митохондриях?

  Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что разобщитель (например, динитрофенол) производит в митохондрии своего рода «короткое замыкание» – ионы Н⁺, выкачанные при работе переносчиков электронов, переносятся обратно динитрофенолом и не идут через фермент Н⁺-АТФ-синтетазу. Окисление больше не сопряжено с фосфорилированием, и дыхательный контроль перестаёт действовать, поскольку вся энергия окисления органических субстратов теперь переходит в тепло, а не на синтез АТФ. В результате скорость дыхания резко возрастает.

• Как определить, какой участок в дыхательной цепи угнетает тот или иной ингибитор?

  Отвечая на этот вопрос, школьники должны знать, что электроны от разных субстратов окисления поступают в дыхательную цепь на разных участках: от НАД∙Н – к самому первому комплексу (НАД∙Н-дегидрогеназному), от сукцината – к следующему (убихинол: цитохром с оксидоредуктазному), а от аскорбата с помощью ТМФД – к последнему (цитохромоксидазному). Значит, если изучить, окисление каких субстратов будет угнетать данный ингибитор, а каких – нет, то можно определить место его действия в цепи переносчиков электронов.

Особенностью виртуального практикума является его максимальная приближённость к реальной работе на полярографе. Так, при экспериментах в присутствии разобщителя митохондрии дышат с высокой скоростью и быстро расходуют весь кислород в ячейке, поэтому надо посоветовать ученикам тщательно продумать свои действия и не тратить время впустую.

В процессе выполнения заданий самостоятельной части практикума у учащихся могут на нескольких этапах встретиться трудности. Учителю следует всячески поощрять стремление школьников самостоятельно выполнить всё задание, нецелесообразно давать ученикам готовые инструкции по решению возникших проблем. Однако, учитель может, не раскрывая сразу же весь алгоритм решения, помочь учащемуся с помощью наводящих вопросов.

Если ученик с самого начала растерялся и не знает, какие вещества ему стоит попробовать испытать при анализе неизвестного яда, то можно посоветовать ему сперва спланировать последовательность экспериментов, которая позволила бы однозначно определить неизвестное вещество. Можно задать наводящий вопрос: «Ты не знаешь, каков механизм действия у изучаемого яда, но можно допустить, что это разобщитель. Какие вещества из предлагаемых в задании ты бы взял для проверки этого предположения?»

Если школьник выберет какой-нибудь субстраты окисления в сочетании с исследуемым ядом, то ему следует проделать соответствующий эксперимент. Если он выберет субстраты в сочетании с динитрофенолом, или субстраты в сочетании с АДФ+фосфат, то ему надо указать, что для проверки гипотезы о том, что неизвестное вещество представляет собой разобщитель, вполне достаточно взять только субстраты и неизвестное вещество – остальное будет просто излишним.

Когда ученик поставит этот виртуальный опыт, то пусть самостоятельно оценит его результаты. В случае, если исследуемый яд будет резко активировать скорость дыхания (в отсутствии АДФ+Ф и динитрофенола), то можно спросить школьника, достаточно ли полученной информации для идентификации исследуемого яда в качестве разобщителя. Если же добавление изучаемого соединения не будет активировать дыхание, то можно задать школьнику наводящий вопрос: «Ты убедился, что этот яд – не разобщитель. Какие эксперименты ты бы поставил для проверки предположения, что исследуемый яд – ингибитор дыхательной цепи?»

Если ученик растеряется, то можно задать ещё один вопрос: «Почему в первом опыте митохондрии дышали очень медленно и что можно сделать для активации их дыхания?» Если ученик не сможет ответить на этот вопрос, то надо напомнить ему вопрос 1 из проведённого опроса. Если же он догадается, что активировать дыхание можно добавлением динитрофенола, то можно задать следующий вопрос: «Как определить место действия ингибитора переноса электронов в дыхательной цепи?»

Если ученик предложит проверить действие неизвестного яда на окисления различных субстратов (α-кетоглютарата, сукцината и аскорбата) в присутствии динитрофенола, то пусть проводит этот эксперимент. Если же школьник не сможет ответить на поставленный вопрос, то следует напомнить ему вопрос 3 из проведённого опроса.

В конце занятия учителю целесообразно провести анализ выполнения задания каждым учащимся. Такой анализ сильно облегчается тем, что при неверном ответе на экране появляется надпись, поясняющая, результат какой именно реакции противоречит выбранному учеником ответу. Эти надписи исчерпывающе объясняют ошибки при трактовке полученных результатов, так что вмешательство учителя не требуется.

В комментирующих ошибки школьника надписях нет указаний, называющих правильный ответ конкретной задачи, они лишь указывают, почему неверен ответ, выбранный учеником. Учитель может или просто назвать правильный ответ на задание, или использовать дополнительные вопросы, приведённые выше.