Процесс синтеза АТФ,использующий энергию окисления органических веществ кислородом, называется окислительным фосфорилированием. Он был открыт советским ученым В. А. Энгельгардтом в 1930-м году в г. Казани.

Именно этот процесс используют для получения энергии большинство животных клеток из самых разных органов и тканей, клетки растений в отсутствие света (когда невозможен фотосинтез), а также клетки грибов и бактерий, живущих в кислородной атмосфере. В эукариотических клетках процесс окислительного фосфорилирования протекает в митохондриях.

Мы уже говорили на 11-м уроке, что окисление органических веществ в живых клетках протекает в два этапа. На первом из них универсальный окислитель НАД⁺ окисляет различные соединения (например, в таких метаболических путях как аэробный гликолиз, цикл Кребса, β-окисление жирных кислот), а на втором этапе его восстановленная форма НАД∙Н окисляется в митохондриях, энергия этого окисления используется для синтеза АТФ. В меньшем числе реакций участвует другой челнок – ФАД. На этом уроке мы рассмотрим реакции второго этапа: окисление НАД∙Н и ФАД∙Н₂.

Окисление НАД∙Н кислородом происходит на внутренней мембране митохондрий. Оно протекает через множество стадий: НАД∙Н отдает свои электроны на некоторые промежуточные вещества, эти вещества передают электроны на следующие промежуточные соединения и т. д., вплоть до кислорода. Кислород, приняв электроны и ионы H⁺ из среды, образует воду. Электроны как бы передаются по цепочке от одного переносчика к другому, поэтому всю совокупность переносчиков называют дыхательной цепью. Ниже приводится схема этого процесса.

ФМН – флавинмононуклеотид – переносчик, похожий по свойствам на ФАД.

FeS-белки – белки внутренней мембраны митохондрий, содержащие комплексы железа, способного изменять степень окисления, с серой.

Убихинон – низкомолекулярное органическое соединение хиноидной природы, оно может существовать в окисленной (убихинон) и восстановленной (убихинол) форме.

Цитохромы – белки, содержащие гем с ионом железа, способным изменять степень окисления.

Сукцинат – ион янтарной кислоты, промежуточного соединения цикла Кребса.

В ряду этих переносчиков НАД∙Н является самым хорошим восстановителем, а НАД⁺ – самым плохим окислителем. Соответственно, О₂ будет самым сильным окислителем, а вода – самым слабым восстановителем. У промежуточных переносчиков будут постепенно ослабевать восстановительные свойства, и усиливаться окислительные, соответственно окислительно-восстановительный потенциал будет возрастать. Электроны, передвигаясь от НАД∙Н к О₂, как бы спускаются по энергетической лестнице.

Эти переносчики организованы в три больших комплекса, каждый из которых содержит несколько полипептидных цепей. Первый комплекс – НАД∙Н: убихинон оксидоредуктаза. Он переносит электроны от НАД∙Н к убихинону.

Убихинон – небольшая молекула, свободно перемещающаяся во внутренней мембране митохондрий. В соответствии с положением на энергетической лестнице, убихинон проявляет промежуточные свойства: его восстановленная форма не такой сильный восстановитель, как ФМН∙Н₂ и тем более НАД∙Н, но сильнее, чем восстановленные цитохромы. Соответственно, его окисленная форма является более сильным окислителем, чем НАД⁺ и ФМН, но слабее, чем окисленные цитохромы.

Другой комплекс называется убихинол: цитохром с оксидоредуктаза, он передает электроны от убихинола на белок цитохром с. Цитохромы – небольшие белки, прочно связанные с небелковой частью, гемом. Гем цитохромов содержит ион железа, способный изменять степень окисления: принимая электрон, он переходит в форму Fe²⁺, а теряя электрон в форму Fe³⁺. Цитохром с свободно плавает по внешней поверхности внутренней мембраны митохондрий. Наконец, последний комплекс, цитохромоксидазный, переносит электроны от цитохрома с на кислород, в его составе содержатся ионы меди и железа.

Каждый из этапов переноса электронов может быть заблокирован специальными ингибиторами (все они ядовиты): инсектицид ротенон угнетает перенос электронов от НАД∙Н к убихинону; антибиотик антимицин А блокирует их путь от убихинола к цитохрому с; цианид ингибирует транспорт электронов от цитохрома с к кислороду.

Применение этих ингибиторов позволило установить последовательность переносчиков в дыхательной цепи. Так, в присутствии ротенона не может протекать окисление НАД∙Н, но может окисляться сукцинат, поскольку он поставляет электроны на убихинон. Антимицин А ингибирует окисление и сукцината, и НАД∙Н, но не препятствует окислению аскорбиновой кислоты в присутствии ТМФД (тетраметилфенилендиамина), поскольку аскорбат поставляет электроны на цитохромоксидазу. Наконец, цианид блокирует окисление всех субстратов.

Энергия, достаточная для синтеза молекулы АТФ, выделяется не на всех этапах передвижения электронов, а только на трех: от НАД∙Н через ФМН к первому FeS-белку; от восстановленного убихинола к цитохрому с1; от цитохрома с к кислороду. Эти участки дыхательной цепи называются пунктами сопряжения окисления и фосфорилирования. При окислении НАД∙Н электроны проходят через все три пункта, а при окислении ФАД∙Н₂ – только через два таких пункта, поэтому при окислении ФАД∙Н₂ образуется меньше молекул АТФ.

В конце 50-х годов английский биохимик П. Митчелл разработал теорию, объясняющую механизм превращения энергии окисления органических веществ кислородом в энергию АТФ. Он предположил, что митохондрия – это маленькая электростанция. Когда электроны идут от НАД∙H к кислороду, то за счет энергии окислительных реакций из матрикса митохондрии через внутреннюю мембрану выкачиваются ионы H⁺. Затем благодаря энергии образовавшегося градиента этих ионов синтезируется АТФ (этот градиент называют также электрохимическим потенциалом).

Согласно теории Митчелла, преобразование энергии в митохондриях происходит следующим образом: энергия окисления НАД∙Н кислородом → энергия градиента ионов H⁺ → энергия химических связей молекул АТФ.

Вода обратимо диссоциирует на ионы H⁺ + OH^–, в нейтральной среде концентрации этих ионов равны 10^–7 М. При откачивании ионов H⁺ (протонов) их концентрация внутри митохондрии падает до 10^–8 М, в цитоплазме же она возрастает незначительно – ведь объем цитоплазмы гораздо больше объема митохондриального матрикса.

Таким образом, на внутренней мембране митохондрии создается градиент протонов: внутри их мало, а снаружи много. Ион H⁺ – заряженная частица, так что на внутренней стороне мембраны возникнет отрицательный заряд, а на наружной – положительный. Разность потенциалов составляет около 220 мВ (0,22 B). На первый взгляд, это очень небольшая величина. Но если вспомнить, что толщина мембраны составляет около 7 нм, то несложные подсчеты показывают – напряженность электрического поля на ней достигает более 300 тыс. вольт на сантиметр! И при таких условиях работает множество ферментов и переносчиков.

ФерментH⁺-АТФ-синтетаза, расположенная на внутренней мембране митохондрий, синтезирует АТФ за счет энергии градиента ионов H⁺. По некоторым данным, для образования одной молекулы АТФ через H⁺-АТФ-синтетазу должно пройти 4 иона H⁺, а по другим – 3 иона (возможно, эта величина различается в разных условиях). Внутри фермента имеется специальный канал для прохождения протонов. Когда протоны проходят по каналу, происходит вращение субъединиц фермента, и в результате фосфорилирования АДФ фосфатом синтезируется АТФ.

Согласно современным данным, в митохондриях млекопитающих при окислении 1 молекулы НАД∙Н через мембрану переносятся 12 ионов Н⁺, а при окислении 1 молекулы ФАД∙Н₂ – 8 ионов Н⁺. Не все они используются для работы H⁺-АТФ-синтетазы – часть энергии тратится на транспорт фосфата и обмен АТФ на АДФ через внутреннюю мембрану митохондрий. Поэтому суммарно при окислении 1 молекулы НАД∙Н образуется около 2,5 молекул АТФ, а ФАД∙Н₂ – около 1,5 молекул (однако, по старым данным – 3 и 2 молекулы, соответственно).

Как уже говорилось на уроке 11, при окислении одного остатка уксусной кислоты в цикле Кребса образуются 3 молекулы НАД∙Н, 1 молекула ФАД∙Н₂ и одна молекула ГТФ. Если считать по современным стехиометрическим данным, то суммарно получается 3 × 2,5 + 1,5 + 1 = 10 молекул АТФ (ГТФ и АТФ легко обмениваются фосфатами). Если же рассчитывать по старым соотношениям, то получится 3 × 3 + 2 + 1 = 12.

При аэробном гликолизе (см. урок 11) из одной молекулы глюкозы образуется 2 молекулы АТФ, 2 молекулы цитоплазматического НАД∙Н и 2 молекулы пирувата. В некоторых органах и тканях НАД∙Н из цитоплазмы попадает в митохондрию без энергетических потерь, тогда как в других энергия теряется, и в митохондрии восстановленным оказывается всего лишь ФАД∙Н₂. 2 молекулы пирувата при окислении дадут 2 молекулы ацетил–КоА и 2 молекулы митохондриального НАД∙Н. По современным стехиометрическим данным суммарно получается 2 + 2 × 2,5 (или 1,5) + 2 × 2,5 + 2 × 10 = 32 (или 30 – в зависимости от ткани) молекул АТФ. По старым соотношениям получается 2 + 2 × 3 (или 2) + 2 × 3 + 2 × 12 = 38 (или 36 в зависимости от ткани). В любом случае, аэробный гликолиз энергетически во много раз выгоднее анаэробного.

Можно провести аналогичные расчеты для β–окисления жирных кислот и сравнить результаты с таковыми для глюкозы. Некорректно сравнивать глюкозу с пальмитиновой кислотой – все-таки у одной 6 атомов углерода, а у другой 16. Поэтому сравним эффективность окисления глюкозы с β-окислением жирной кислоты С₅Н₁₁–СООН. При ее окислении сначала пришлось бы затратить 2 молекулы АТФ на присоединение коэнзима А. На выходе мы бы получили 2 НАД∙Н, 2 ФАД∙Н₂ и 3 ацетил-КоА. По современным данным получается –2 + 2 × 2,5 + 2 × 1,5 + 3 × 10 = 36 молекул АТФ. По старым соотношениям получится –2 + 2 × 3 + 2 × 2 + 3 × 12 = 44. В любом случае, при окислении жирной кислоты выход АТФ получился выше, чем при окислении глюкозы.

Окислительное фосфорилирование регулируется по механизму отрицательной обратной связи. Во-первых, высокие концентрации АТФ ингибируют фермент цитохромоксидазу. Во-вторых, первые два пункта сопряжения окисления и фосфорилирования обратимы, при высоком уровне мембранного потенциала они близки к равновесию (в определенных условиях наблюдается даже обратный поток электронов). Благодаря этому, когда концентрация АТФ в митохондрии высока, скорость дыхания падает, а при снижении уровня АТФ – возрастает. Это явление получило название дыхательного контроля.

Если внутреннюю мембрану митохондрий сделать проницаемой для ионов, то произойдет как бы «короткое замыкание»: за счет энергии окисления НАД∙Н кислородом ионы Н⁺ будут выкачиваться из внутреннего пространства митохондрии, но через «дырку» тут же заходить обратно. При этом вся образующаяся энергия будет рассеиваться в виде тепла. Есть специальные вещества, – разобщители окисления и фосфорилирования – которые делают мембрану проницаемой для ионов Н⁺. При добавлении разобщителей митохондрии очень интенсивно потребляют кислород, но не синтезируют АТФ.

Иногда разобщение окисления и фосфорилирования бывает полезным. У многих грызунов, впадающих в зимнюю спячку, имеется специальная ткань – бурый жир. Эти грызуны просыпаются весной, когда температура воздуха еще низкая. Митохондрии бурого жира «дырявые», их внутренняя мембрана проницаема для ионов Н⁺. Вся энергия окисления жира переходит в тепло, что позволяет грызуну согреться. Бурый жир имеется и у новорожденных детенышей большинства видов млекопитающих, в том числе человека. Митохондрии в других тканях тоже умеют перестраиваться для нужд обогрева. Когда нам холодно, некоторая часть протонов (ионов Н⁺) возвращаются в митохондрию не через Н⁺-АТФ-синтетазу, а через «дырочки», при этом часть энергии протонного градиента переходит в тепло. Гормоны щитовидной железы, регулирующие энергетический обмен, увеличивают количество таких «дырочек» в митохондриях.

Электрохимический потенциал используют для синтеза АТФ не только митохондрии, но и многие бактерии. Все аэробные бактерии имеют систему переносчиков электронов от НАД∙Н к кислороду, и у большинства из них эта система схожа с митохондриальной. При движении электронов по этой цепочке из цитоплазмы выкачиваются ионы H⁺ в окружающую среду. У бактериальной клетки обычно нет мембранных органелл, и аналог внутренней мембраны митохондрий – цитоплазматическая мембрана бактерии. На мембране образуется электрохимический потенциал, и мембранная H⁺-АТФ-синтетаза синтезирует АТФ за счет энергии градиента H⁺.

У бактерий наблюдается гораздо большее разнообразие типов обмена веществ, но все же главные особенности преобразования энергии «по Митчеллу» у большинства бактерий имеются: окислительно-восстановительные реакции, сопровождающиеся движением электронов по цепи переносчиков → градиент ионов H⁺ → синтез АТФ протонной АТФ-синтетазой.

У бактерий электрохимический потенциал играет чрезвычайно важную роль: он используется не только для синтеза АТФ, но также для транспорта различных веществ и для движения. Бактериальный жгутик сильно отличается от эукариотического. Во-первых, он не гибкий, а жесткий: это «штопор», а не «хлыст». Во-вторых, он движется не за счет энергии АТФ, а за счет энергии электрохимического потенциала: в основании «штопора» располагается настоящий электромотор, работающий, правда, не на токе электронов, а на токе ионов H⁺. Эти ионы идут по градиенту концентрации из наружной среды в цитоплазму бактерии, а энергия используется на вращение жгутика, благодаря чему и движется микроб.

На один оборот жгутика у бактерии кишечной палочки затрачивается около 1200 ионов H⁺, при этом скорость вращения составляет 300 оборотов в секунду. Скорость движения этой бактерии достигает 30 микрометров в секунду, т. е. за секунду бактерия проплывает расстояние в 15 раз больше своей собственной длины. Если бы так умела плавать подводная лодка длиной 90 метров, то она развивала бы скорость 4860 километров в час.

В хлоропластах растений в процессе фотосинтеза также образуется электрохимический потенциал на мембранах тилакоидов, который используется для синтеза АТФ. Суммарное уравнение фотосинтеза выглядит так: 6СО₂ + 6Н₂О → C₆Н₁₂О₆ + 6О₂.

Фотосинтез включает две стадии: световую и темновую. На первой, световой, стадии за счет энергии света в хлоропласте образуются особые вещества, которые на второй стадии используются для превращения СО₂ в глюкозу. Не следует считать, что световая фаза идет днем, а темновая – ночью: вещества, образующиеся в ходе световой фазы, быстро используются клеткой, так что весь фотосинтез протекает днем, а ночью растения живут за счет дыхания, как и животные. Темновая фаза представляет собой ряд сложных химических реакций, для протекания которых необходимо наличие АТФ, а также восстановителя для восстановления СО₂. Как Вы уже знаете из предыдущих уроков, НАД∙Н, играет важную роль в биологическом окислении веществ, а в фотосинтезе в качестве восстановителя используется очень похожее вещество НАДФ∙Н (никотинамидадениндинуклеотидфосфат). Этот конфермент содержит лишнюю фосфатную группу при втором атоме рибозы адениловой части кофермента.

НАДФ∙Н тоже может существовать в двух формах: НАДФ⁺ (окисленная форма) и НАДФ∙Н (восстановленная форма). Обычно в клетке концентрация НАД∙Н в сотни раз меньше, чем НАД⁺, а вот концентрация НАДФ∙Н примерно в тысячу раз больше, чем НАДФ⁺. Такое различие связано с тем, что кофермент НАД служит в основном для окисления различных веществ, а НАДФ – для восстановления.

Темновую стадию мы рассмотрим на следующем уроке. Сейчас нам важно, что для ее протекания необходимо наличие АТФ и восстановленного НАДФ∙Н.

В световой фазе фотосинтеза важнейшую роль играет зеленый пигмент хлорофилл. Он располагается на мембранах тилакоидов – замкнутых пузырьков внутри хлоропласта.

В составе молекулы хлорофилла имеется нескольких сопряженных колец, с которыми связан ион Mg²⁺, а также гидрофобный «хвост» – фитол, который заякоривает всю молекулу на мембране.

Хлорофилл способен поглощать кванты света, при этом он из обычного состояния переходит в особое, возбужденное: Хл → Хл*. В возбужденном хлорофилле электрон переходит на более высокую орбиталь, он почти отрывается от молекулы хлорофилла, «держится на честном слове». Поэтому Хл* является хорошим восстановителем – он легко отдает свой полуоторванный электрон.

В ходе фотосинтеза Хл* отдает свой электрон промежуточному переносчику – акцептору электрона. После отрыва электрона ион Хл⁺ стал сильным окислителем. Он отнимает электроны у другого промежуточного переносчика – донора электрона, а сам возвращается в исходное состояние.

В этой системе одно и то же вещество оказалось одновременно и сильным окислителем в форме Хл⁺, и сильным восстановителем в форме Хл*. На первый взгляд, это противоречит законам химии. Но не будем забывать, что источником этих волшебных превращений служит энергия света – именно она дает возможность хлорофиллу подниматься вверх по энергетической лестнице при переходе Хл → Хл*.

На следующих этапах восстановленный акцептор электрона передаст его с помощью еще нескольких переносчиков к молекуле НАДФ⁺ и восстановит ее до НАДФ∙Н. Донор электрона для возвращения в исходное состояние должен вернуть себе электрон, отняв его у какой-нибудь молекулы. У очень древних организмов – серных бактерий – он отбирает электрон у сероводорода, окисляя его до молекулярной серы. Этот способ проведения фотосинтеза имеет огромный недостаток – зависимость от источника сероводорода. Зеленые растения и сине-зеленые водоросли сделали огромный шаг вперед, они научились окислять воду, выделяя кислород. Вода имеется повсеместно, что и позволило этим организмам завоевать всю биосферу.

Однако вода является очень плохим восстановителем. Энергии одного кванта света для переноса электронов от воды к НАДФ⁺ недостаточно – уж слишком велико различие окислительно-восстановительных потенциалов этих молекул. Поэтому необходимо использовать два кванта света, уловив их двумя молекулами хлорофилла. Одна молекула хлорофилла отрывает электрон от воды и через цепочку переносчиков передает его другой молекуле хлорофилла, которая с его помощью восстанавливает НАДФ⁺.

Хлорофилл, окисляющий воду, вместе со своей группой переносчиков электронов, образует фотосистему II, а хлорофилл, восстанавливающий НАДФ⁺, со своими переносчиками – фотосистему I. Некоторые промежуточные переносчики электронов в фотосистемах похожи на переносчики электронов в дыхательной цепи митохондрий. Вещество хиноидной природы пластохинон очень похоже на убихинон, в фотосистеме также встречаются цитохромы и железо-серные белки, сходные с белками дыхательной цепи. Но некоторые переносчики хлоропласта не имеют митохондриальных аналогов: небольшой медь-содержащий белок пластоцианин, содержащий железо и серу белок ферредоксин, и конечно фермент, окисляющий воду (он содержит ион марганца).

Мало того, что работа фотосистем движет электрон по цепи переносчиков от воды к НАДФ∙Н, при этом движении еще и образуется электрохимический потенциал: внутрь полости тилакоида закачиваются ионы Н⁺. На мембране тилакоида есть фермент Н⁺-АТФ-синтетаза, который синтезирует АТФ из АДФ и фосфата при перемещении ионов Н⁺ по градиенту. Преобразование энергии в этом случае проходит по схеме:

энергия света → энергия возбужденных молекул хлорофилла → энергия градиента ионов Н⁺ → энергия АТФ.